ДНҚ-ның нуклеотидтер қатарын анықтау

0

1. ДНҚ тізбегінің нуклеотидтер қатарын анықтаудың Максам-Гильберт әдісі

2. ДНҚ тізбегінің нуклеотидтер қатарын анықтаудың Сэнгер әдісі

Қолданылатын әдебиеттер тізімі.

Негізгі әдебиеттер:

1.Б.Бегімқұлов Молекулалық генетика және биотехнология негіздері. Алматы, «Білім» 1996.

2.Дж.Уотсон, Дж.Туз,Д.Курц.Рекомбинантные ДНК.М.Мир, 1986г.

3.А.Сассон Биотехнология:свершения и надежды   Москва “Мир” 1987 г.

4.Маниатс Т.Фрич Э.Дж.Сэмбрук. Методы генетической инженерии.Молекулярное клонирование.М.Мир 1984г.

5.Инге-Вечтомов С.Г.Введение в молекулярную генетику.М.Высшая школа,1983г.

Қосымша әдебиеттер:

6.Новое вклонировании ДНК.Методы / Под ред. Д.Гловера.М.Мир, 1989г.

7.Льюин Б.Гены.М.Мир, 1987г.

8.Мобильность генома растений /Под ред.Б.Хон и Е.С. Деннис.М.Во “Агропромиздат” ,1990г

9.Пирузян Э.С. Основы генетической инженерии растений.М Наука,1988г.

10.Созинов А.А. Ақуыздың полиморфизмі және оның генетика мен селекциядағы маңызы. М. Наука. 1985 ж. 272 бет.

1.Ген инженериясының соңғы этапында алынған ДНҚ үзіндісінің нуклеотидтер қатарын анықтау керек. Көп жылдар бойы бұл проблеманы шешу үшін ғалымдар әр түрлі әдістерді қолданды, алайда оның ешқайсысы ойдағыдай болмады. Ақырында ген инженериясы әдістерінің дамуымен бұл проблема 1977 ж. таза химиялық әдіс арқылы шешімін тапты.

Қазіргі кезде ДНҚ тізбегінің нуклеотидтер қатарын анықтау үшін екі әдіс — Максам-Гилберт және Сэнгер-кең қолданылады. Екі әдістің де мәні мөлшері бойынша бір негізге айырмашылығы бар жалғыз тізбекті ДНҚ молекуласын алудан тұрады. Мұндай молекулаларды электрофорез көмегімен акриламид гелінде бөлуге болады. Мөлшері әр түрлі белдеулер ұзындығы 300 нуклеотидке дейін жететін «саты» түзейді.

Бірінші әдісті АҚШ ғалымдары У. Гилберт пен оның шәкірті Л. Максам ұсынды. Мұнда қостізбекті ДНҚ үзіндісінің 5’— ұштарын радиоактивті фосформен белгілейді. Мұны ішек таяқшасын зақымдайтын, Т4 бактериофагынан бөлінген полинуклеотидкиназа іске асырады. Бұл фермент АТФ молекуласынан фосфат тобын ажыратып, полинуклеотидтің 5’— ұшына жалғайды. Бұдан кейін қос тізбекті ДНҚ-ны денатурациялап, ДНҚ-ның жеке тізбектерін гелде электрофорез арқылы айырады. Мұнан соң тізбектің әрқайсысын гелден жеке жуып алып, бөлек зерттейді. Ары қарай, үлгілерді төрт бөлікке бөледі. Біріншісіне ДНҚ-ны кез келген аденинді нуклеотидінен кейін үзетін ерітінді қосады. Оны ДНҚ тізбегінің бір аденин бөлігін  ғана үзетіндей етіп қосу керек. Нәтижесінде тізбекте адениннің әр қилы орналасуына байланысты ұзындығы әр түрлі ДНҚ үзінділері пайда болады.

Дәл осындай жолмен басқа үш бөлікті де ДНҚ-ны тиминнен, гуаниннен және цитозиннен  кейін үзетін реагенттермен өңдейді.  Барлық төрт үлгідегі ДНҚ үзінділері бір-біріне параллель орналасып, полиакриламид гелінде электрофорез арқылы айырады: молекуласы аз кесінділер жоғары молекулалы  кесінділерге карағанда гельде жылдам қозғалады.Мұнда қолданылатып электрофорез әдісі жақсы жетілген,  ол барлық    ДНҚ фрагментерін ұзындығы   бойынша жеке бөліктерге айыруға мүмкіндік береді. Қазіргі кезде ұзындығы 300-ге дейін ДНҚ тізбегінің нуклеотидтер катарын анықтаудың ешқандай қиындығы жоқ.

Геннің нуклеотидтер қатарын оқу үшін қараңғыда гелдің үстіне рентген фотопленкасын беттестіреді, мұнда радаоактивті таңба бар орындар ғана таңбаланады.   Фотопленкада 5/ — ұштары белгіленген ДНҚ кесінділері ғана көрінеді, ал олардың гелдің басынан жылжыған ара қашықтығы кесіндінің ұзындығына дәлме-дәл келеді. Енді ДНҚ тізбегін төменнен жоғары қарай оқып, геннің нуклеотидтік қатарын анықтауға болады.

Зерттеуші екінші комплементарды ДНҚ үзіндісінің нуклеотидтер қатарын анықтап, бірінші тізбектен алынған мәлімет дұрыстығын тексере алады. Мұнда тек, бірінші тізбектегі аденин мен цитозиннің орнына екінші тізбекте тимин мен гуаниннің сәйкес келетінін естен шығармау керек.

2.ДНҚ-ның нуклеотидтер қатарын анықтаудың екінші тәсілін Нобель сыйлығының екі дүркін лауреаты атанған ағылшынның атақты ғалымы Ф. Сэнгер ұсынды. Сэнгер әдісінің көп жақтары Максам-Гильберт әдісімен ұқсас болғанымен оның принципінің айырмашылығы бар — Сэнгер бойынша нуклеотидтер қатарын анықтау ДНҚ-полимераза яғни ДНҚ-ны ажырататын емес, керісінше оны синтездейтін фермент көмегімен іске асады. Мұнда ген үзіндісінің өзі емес, ДНҚ-полимеразаның көмегімен синтезделетін ДНҚ молекуласы зерттеледі. Ферменттің әсерімен ұзындығы әр түрлі ДНҚ молекулалары синтезделеді, олардың 5’— ұштары бірдей, ал 3’— ұштары төрт азоттық негіздің (А, Т, Г немесе Ц) бірі бойынша әр түрлі.

Сэнгер әдісінде нуклеотидтер қатары белгісіз ДНҚ сегментін М1З бактериофагының ДНҚ-сынан құрастырылған арнайы векторға енгізеді. Біз бұл фагтың векторлық молекула ретінде ыңғайлы айырмашылығын жоғарыда қарадық, атап айтқанда генді жалғыз тізбекті күйде тасымалдай алады. Мұндай тізбектің нуклеотидтер қатарын анықтау оңай. М1З бактериофагының ДНҚ-сы қос тізбекті күйде де бола алады. Осындай фагтың негізінде бірнеше векторлар құрастырылды. Фагтың репликациясы үшін оның геномының маңызды емес аймағына шамамен ондаған әр түрлі рестриктазалар үзе алатын полилинкер жалғанады. Полилинкердің қатарына 17 н. ж. құралған тізбек жалғанады. Осындай векторды рестриктазалардың бірімен үзгеннен кейін оны талдауға алынған және сол рестриктазамен үзілген ДНҚ бөлігімен біріктіреді. Мұнда ол вектордың 17 мүшелік тізбегімен қатар орналасады. Міне осындай рекомбинантты ДНҚ-ны бактерия клеткасына енгізіп, одан жалғыз тізбекті ДНҚ-сы бар фагтарды алады. Енді фагтан ДНҚ-ны айырьш, оны талдауға кірісуге болады.

Сэнгер әдісі «тізбекті үзу» әдісі деп аталады. Яғни ДНҚ-полимераза арқылы түзілетін комплементарлы ДНҚ-ның синтезі Максам-Гилберт әдісіне сәйкес әрбәр негізде тоқтайды. (үзіледі).Ал, ДНҚ-полимераза үшін ашытқы (праймер) керек, ол үші фектордың 17-мүшелік тізбегіне комплементарлы олигонуклеотид синтезделеді.

Егер олигонуклеотид-ашытқыны матрицалық ДНҚ-мен байланыстырып, ДНҚ-полимераза мен дезоксинуклеозид-трифосфаттарды қосса, онда ДНҚ бөлігінің толық көшірмесін ала аламыз. Мұнда әрбір келесі азоттық негіз өсіп жатқан тізбектің 3’— ұшының гидроксил тобына жалғанатынына мән беру керек. Сэнгер әдісі үшін ДНҚ бөлігінің толық көшірмесі емес, оның үзінділері қажет.

Матрица-ашытқы комплексін төрт бөлікке бөледі   де, олардың әрқайсысына тізбектің 3’— ұштары азоттық негіздерінің     аналогтары — дидезоксинуклеозидтрифосфаттарды (ddNТФ) қосады. Мұндай дидезоксинуклеозидтердің рибоза қалдығының көміртегі атомдарында гидроксил тобы болмайды, сондықтан өсіп жатқан 3’— ұшының синтезін белгілі негізден кейін тоқтайды. Мысалы, тимидинмен аяқталатын ДНҚ фрагменттерін алу үшін ортаға дидезокситимидинтрифосфатты, тізбекті аденозин бойынша үзу үшін дидезоксиаденозинтрифосфатты және т.с.с. қосады. Әрине, төрт бөліктің әрқайсысына қалыпты  дезоксинуклеозидтрифосфаттардың бірін (dТТФ, dАТФ,   (dЦТФ және dГТФ) қосу керек. Нәтижесінде ұзындығы әр түрлі, бірақ 3’— ұштары бірдей олиго — және полинуклеотидтер жиынтығын алады. Олардың электрофореграммасын радиоаутография әдісі арқылы оқып, геннің нуклеотидтер қатарын анықтайды.

Максам-Гилберт және Сэнгер әдістеріе қолданып, РНҚ тізбегінің нуклеотидтер қатарын да анықтауға болады. Бұл әдістердің осы заманғы молекулалық биология мен гепетика үшін маңызы зор. Оларды пайдалану арқасында қазіргі кезде көптеген вирустар, бактериялар және олардың плазмидалық элементтері геномдарының алғашқы құрылымы анықталды. Нуклеотидтері белгілі гендердің ұзындығы 6 млн. асьш кетті. Қазіргі кезде кейбір митохондрия мен хлоропластардың ДНҚ құрылымы толық белгілі болды, олардың ДНҚ молекуласының ұзындығы 150 н. ж. асып түсті.

Осы заманғы генетикалық инженерияның жетістігін адам геномына инструменттік шабуыл басталуынан байқауға болады. Адам ДНҚ-сының нуклеотидтер қатарын анықтауды АҚШ ғалымдары тікелей қолға алуда. Адамның ДНҚ-сы 3 млрд. нуклеотидтерден құралған, сондықтан олардың орналасу қатарын анықтау көп қаражатты және көптеген ғылыми генетикалық зертханалардың бірігіп жұмыс істеуін керек ететін аса күрделі іс болып саналады. Кейбір ғалымдардың есебі бойынша 3—6 млрд. доллар (әр нуклеотидке 1 — 2 доллар) жұмсап, адам геномының проектісін 15—20 жыл аралығында шешуге болады. Қазіргі кезде нуклеотидтерді анықтау жылдамдығын көбейтіп, жұмсалатын қаржыны азайту (әр нуклеотидке 50 цент жұмсау) жолдары талқылануда. Мысалы, Сэнгер бойынша нуклеотидтер қатарын анықтаудың автоматты әдістері құрастырылды, мұндай жаңа автоматты приборлар адам геномының оқылуын жеңілдетеді деп күтілуде.

ОСТАВЬТЕ ОТВЕТ