Бөтен гендердің микроорганизмде жұмыс істеуі

0

1. Күшті промотрды таңдау

2. Эукариоттық құрылымды бактериялық геномға енгізу

3. Бөгде геннің бактериялық клеткада жұмыс істеуі

Қолданылатын әдебиеттер тізімі.

Негізгі әдебиеттер:

1.Б.Бегімқұлов Молекулалық генетика және биотехнология негіздері. Алматы, «Білім» 1996.

2.Дж.Уотсон, Дж.Туз,Д.Курц.Рекомбинантные ДНК.М.Мир, 1986г.

3.А.Сассон Биотехнология:свершения и надежды   Москва “Мир” 1987 г.

4.Маниатс Т.Фрич Э.Дж.Сэмбрук. Методы генетической инженерии.Молекулярное клонирование.М.Мир 1984г.

5.Инге-Вечтомов С.Г.Введение в молекулярную генетику.М.Высшая школа,1983г.

Қосымша әдебиеттер:

6.Новое вклонировании ДНК.Методы / Под ред. Д.Гловера.М.Мир, 1989г.

7.Льюин Б.Гены.М.Мир, 1987г.

8.Мобильность генома растений /Под ред.Б.Хон и Е.С. Деннис.М.Во “Агропромиздат” ,1990г

9.Пирузян Э.С. Основы генетической инженерии растений.М Наука,1988г.

10.Созинов А.А. Ақуыздың полиморфизмі және оның генетика мен селекциядағы маңызы. М. Наука. 1985 ж. 272 бет.

1. Прокариоттар гендері жұмыс істеуінің немесе экспрессиясының механизмі бүгінгі күні жақсы зерттелген және Е. СоІі бактериясы мен кейбір оның фагтарын көпжылдық іргелі молекулалық-биологиялық зерттеулер арқасында түсінікті бола бастады. Алдымен, прокариоттық геннің экспрессиясы деп осы генде иРНҚ синтезделуін (транскрипция кезеңі) және иРНҚ-ның рибосомадағы трансляциясын (белок синтезін) түсінетінін еске түсірейік.Белок синтезінің бірінші кезеңі — трапскрипцияның инициация процесінде РНҚ-полимераза ферменті промотор деп аталатын ДНҚ-ның ерекше бөлігін тануы керек, тек сонда ғана ДНҚ-ның қос тізбегі ажырап, иРНҚ синтсзделуі бастала алады. Демек, адам немесе жануар генінің бактерия клеткасында жұмыс істеп, қажет биотехнологиялық өнім (белок) түзуі үшін, ең алдымен, оның алдында бактериялық РНҚ-полимераза байланыса алатын прокариоттық күшті промотор болуы керек.

Транскрипцияның жоғары деңгейі плазмидалық репликацияның тұрақсыздығына әкелетін атап өту керек. РНҚ-ның ғана емес, әсіресе көптеген белоктардың мөлшерден тыс синтезделуі клетканың жойылуына әкелуі мүмкін. Осындай жағдай болмас үшін пәрменді транскрипцияланатын геннің  соңында трапскрипцияны тиімді терминациялайтын (тежейтін) нүктелер болуы керек. Практикалық мақсат үшін реттелетін транскрипцияны қолдану ыңғайлы.

Ген инженериясында бірнеше күшті промоторлар белгілі: Е. СоІі оперондарының промоторлары — LacUY5 (лактоза), trp (триптофан) және гибридтік промотор tас (trp — Lас); лямбда фаг промоторлары — РR мен РL; т 5, т 7, Х 174 және т. б. фагтардың промоторлары.

2.Ген жұмысының аяқталуы үшін иРНҚ-ның белокқа трансляциялануы қажет. Прокариоттық және эукариоттық клеткалардың молекулалық-генетикалық құрылымының айырмашылықтарына орай трансляция процесі өтуі үшін де белгілі қиындықтарды жеңуі керек. Бұл айырмашылықтар, атап айтқанда, рибосоманың, әсіресе, белоктың амин қышқылдар тізбегін коделейтін иРНҚ-ның молекулалық-генетикалық құрылымына байланысты. Прокариоттық иРНҚ-ның инициалаушы кодонының (АУГ) алдында (3—12 нуклеотид бұрын) Шайн-Делгарно (SD) тізбегі деп аталатын, 3—9 нуклеотидтерден құралған ерекше бөлігі бар. Бұл тізбек рибосомалық 163 РНҚ-ның 3’— ұшына комплементарлы болғандықтан иРНҢ-ның рибосомамен байланысуын қамтамасыз етеді.

Сонымен эукариоттық геннің реттеуші бөліктері бактериядан үлкен айырмашылығы бар және оларды бактериялық РНҚ-полимераза мен рибосомалар тани алмайды. Осыған орай, бөтен ген өз қызметін бактерия клетканың ішінде іске асыруы үшін екі жағдайды керек етеді: 1) геннің алдында бактериялық РНҚ-полимераза тани алатын күшті промоторды; 2) иРНҚ трансляциясының инициациясы үшін SD — тізбегі керек. Қазіргі кезде эукариоттық геннің реттеуші бөлігін бактериялық реттеуші бөліктерімен (промотор және SD — тізбекпен) алмастыруды мүмкін ететін бірнеше әдістер белгілі.

3.Бөтен геннің клеткадағы жұмысын іске асырудың екінші жолы — өзінің реттеуші бөліктері жоқ эукариоттық құрылымды ген функциясы жоғары бактериялық геномның арасына енгізу. Мұнда коделенетін құрылымды ген бактериялық промотормен,  SD — тізбегімен және АТГ инициациялаушы кодонмен жалғанады, нәтижесінде шамалы ғана өзгерген қажет белок бірден синтезделеді.

Бөтен геннің активтілігін клеткада қамтамасыз ету үшін оны бактериялық геннің бірімен (реттеуші бөліктері бар) жалғауға болады. Осындай жолмен 1977 ж. Бойер мен Итакура лактоза промоторын қолданып, сүтқоректілердің соматостатин гормонын Е. Соlі клеткасында синтездей алды. Бұл гормон гипоталамуста өте аз мөлшерде түзіледі және қанға инсулин мен өсу гормонының (соматотропиннің) түсуін реттейді. Оның молекуласы күрделі емес, бар болғаны 14 амин қышқылдарынан құралған, сондықтан соматостатиннің гені өте ұсақ. Осыған байланысты, алдымен, ұзындығы 42 нуклеотидке тең ДНҚ молекулаласын химиялық жолмен синтездейді (гормонның амин қышқылдар қатары белгілі және оның әрқайсысының триплетін генетикалық код арқылы табады). Осы синтетикалық генді рВR322 плазмидасына және E. Соlі геномының  — галактозидаза геннің соңына біріктіру үшін қосымша қысқа линкер тізбектерін (рестриктазалық жабысқақ ұштар) жалғады. Нәтижесінде синтетикалық қос тізбектің ұзындығы 52 жұп нуклеотидке тең болды: геннің N — ұшында метионинді коделейтін АТГ кодоны және ЕсоR1 рестриктазасы жабысқақ ұштар етіп, үзе алатын ААТТ тізбегі бар, ал С — ұшында екі стоп-кодон орналасты. ДНҚ-ның осы бөлігін   промоторы және операторы бар — галактозидаза генінің бөлігіне жалғап, олардың барлығын вектор — рВR322 плазмидасына біріктірді. Осындай біріктірудің нәтижесінде гибридті ген алынды, мұнда  — галактозидаза гені бөлігінің С — ұшы соматостатин генімен ауыстырылды. Бактериялык  — галактозидаза гені мен соматостатин генінің арасында метионин кодоны орналасқан. Бұл гибридтің транскрипциясы мен трансляциясы — галактозидазаның реттеуші элементтерінің арқасында іске асты. Осындай  — галактозидазаның рекомбинантты гені өзінің Е. Соlі клеткасына трансформацияланғаннан кейін өз жұмысын тамаша іске асыра алады. Нәтижесінде гибридті белок синтезделді, мұнда соматостатин  — галактозидазалық бөліктен метионин арқылы жекеленеді. Жай химиялық қосылыс — бромциан (ВrСN)—белоктарды метионин бойынша ажыратады. Соматостатиннің өзінде метионин қалдығы жоқ болғандықтан, оны таза күйінде жеке фракцияға бөлуге болады.

Көпшілік жағдайда, белок цитоплазмада түзілгеннен соң клетканың мембранасы арқылы оның сыртына тасымалдануы керек. Бұл үшін геннің N— ұшында клеткалық мембранаға жақындығы бар ерекше тізбек орналасуы қажет. Бұдан басқа эукариоттардың бірқатар белоктары синтезделу аяқталғаннан кейін полиглюколизденеді: белокқа полисахаридтің қысқа тізбегі жалғанады, бұл оның  активтілігіне және клетка ішінде тасымалдануына әсер етеді. Қазіргі кезде бактериялық клеткада белоктарды глюкозалау өте қиын. Бір тәуірі, көптеген белоктар (интерферон және т. б.) полисахаридтік жалғану болмаса да активтілігін жоғалтпайды. Егер мұндай модификациялық өзгеріс қажет болса, онда генді эукариоттар клеткасына енгізуге тура келеді. Бұдан бөлек, бактериялық клеткада эукариоттық геннің интрон бөліктерін үзе алатын ферменттік жүйе жоқ. Осыған орай прокариоттар ген инженериясында сплайсингтен өткен эукариоттық иРНҚ ғана пайдаланылады. Эукариоттық генді эукариоттық клеткаларға немесе организмге енгізіп, оның өнімін алу биотехнологияның болшақтағы маңызды мақсаты болып саналады.

ОСТАВЬТЕ ОТВЕТ