Рекомбинантты ДНҚ молекуласын клеткаға тасымалдау және ген клонын көбейту

0

1.рДНҚ-ны клеткаға енгізу

2.Ген клонын көбейту

3.Скрининг

Қолданылатын әдебиеттер тізімі.

Негізгі әдебиеттер:

1.Б.Бегімқұлов Молекулалық генетика және биотехнология негіздері. Алматы, «Білім» 1996.

2.Дж.Уотсон, Дж.Туз,Д.Курц.Рекомбинантные ДНК.М.Мир, 1986г.

3.А.Сассон Биотехнология:свершения и надежды   Москва “Мир” 1987 г.

4.Маниатс Т.Фрич Э.Дж.Сэмбрук. Методы генетической инженерии.Молекулярное клонирование.М.Мир 1984г.

5.Инге-Вечтомов С.Г.Введение в молекулярную генетику.М.Высшая школа,1983г.

Қосымша әдебиеттер:

6.Новое вклонировании ДНК.Методы / Под ред. Д.Гловера.М.Мир, 1989г.

7.Льюин Б.Гены.М.Мир, 1987г.

8.Мобильность генома растений /Под ред.Б.Хон и Е.С. Деннис.М.Во “Агропромиздат” ,1990г

9.Пирузян Э.С. Основы генетической инженерии растений.М Наука,1988г.

10.Созинов А.А. Ақуыздың полиморфизмі және оның генетика мен селекциядағы маңызы. М. Наука. 1985 ж. 272 бет.

 

1. Рекомбинантты. ДНҚ-ны клеткаға енгізу. Гибридті молекулаларды клеткаға енгізу тәсілі векторға байланысты. Егер вектор ретінде плазмида қолданылса, онда енгізу трансформация типімен, егер фаг қолданылса, онда трансфекция (клетканың фаг ДНҚ-сы арқылы инфекциялануы) типімен өтеді. Трансформация мен трансфекцияның жалпы жолы бактерия клеткасын кальций тұздарымен   (Са С12) өңдегенде, олардың мембраналарының ДНҚ-ны өткізе алатындығына негізделеді. Экзогенді (бөтен) ДНҚ-ның клеткаға ену тиімділігі төмен. Алдын ала СаСІ2-мен өңделген клеткаға, мысалы, 1 мкг рВR322 плазмидасын қосса, онда әрбір 104—105 плазмиданың біреуі ғана клетканың ішіне енеді яғни   бактериялардың азғантай бөлігі   ғана

трансформациялана алады. Оларды басқалардан бөлу бактерия клондарын алу процесінде іске асады.

Әдетте, модификацияланбаған ДНҚ молекуласын (метилаза ферментімен метилденбеген) бактерия клеткасының рестрикциялық ферменттері ыдыратып жіберетінін біз білеміз.Ал,  клеткаға рекомбинантты ДНҚ молекуласының көп  мөлшерін енгізсе, онда оның рестриктаазлары оларды ыдыратып үлгере алмайды. Бактериялық рестриктазалар кесіп үлгірмеген рДНҚ-ның біраз бөлігі рестриктаза танитын орындарда метилденіп — модификацияланып кетеді. Ғалымдар генетикалық инженерия тәжірибелерінде  рестрикциялық ферменттері жоқ бактериялық клеткаларды жиі қолданады. Мұндай рестрикцияланбайтын клеткаларда әдетте модификациялаушы ферменттер де жоқ болады.

2.Ген клонын көбейту. Белгілі концентрациялы бактериялық суспензияны қатты ет-пептондық қоректік ортаға, мысалы, қосымша қоректік заттар бар агарга егеді, сонда Петри шыны ыдысының 1см2 бетіне 1—10 бактериялар келуі керек. Агардың үстіне түскен бактериялық клеткалар бөліне бастайды, соңында олардың әрқайсысының көптеген ұрпақтары сыртқы пішіні бойынша саңырауқұлақтың қалпақшасына ұқсас кішігірім шоғырлар түзейді. Әр шоғырда бастапқы бір бактериялық клеткадан түзілген және одан ешқандай айнымайтын көптеген клеткалар бар, оны клон деп атайды. Бастапқы суспензияның әрбір клеткасы да өз клонын түзейді (позитивтік колония).

Вектор ретінде бактериофагты қолданғанда генді бактерияға енгізу және соңғыны қоректік ортада өсіру жоғарыдағыдай  плазмидалық вектор қолданғандағыдай өтеді.Фаг ДНҚ-сы (енбеген  клеткалар агарда көбейіп, көмескі тегіс «газон» түзейді.   Ал, фаг ДНҚ-ы бар   бактериялар түскен орындарда мөлдір дөңгелек ойыстар түзіледі, оларды негативтік шоғыр деп атайды. Негативтік   шоғырдың түзілуі клеткада фаг ДНҚ-ның репликациялануына және жетілген  фагтардың пайда болуына   байланысты. Бұдан кейін фагтар басқа клеткаларға еніп, оларлы ыдыратады, нәтижесінде  әрбір ойын бір ғана ДНҚ-сы клеткаға енген  ДНҚ-ның   копиясы бар фаг ұрпақтарынан тұрады.

 М13 фагы клетканы лизиске әкелмегендіктен негативтік шоғыр түзбейді. Бірақ олар көбейген орындарда бактериялық клетканың  бөлінуі бәсеңдейді, сондықтан жалпы көмескі  газонда мөлдірлеу ойыстар пайда болады. Соңғы  газонда қажет рДНҚ молекулалары енген     бактериофагтардың көбеюі өтеді.

Қазіргі кезде ген инженериясында ген  клонын көбейтудің екі әдісі кең қолданылуда: геномның жеке фрагментін (кДНҚ-ны қажет геннің иРНҚ молекуласынан кері транскрптаза ферменті көмегімен алу) және барлық геном клонын көбейту.

Комплементарлы ДНҚ (кДНҚ) клонын көбейту әдісін организмнің қайсы клеткаларында кажет белок синтезделетінін білгенде ғана алуға болады. Оның үстіне белоктың синтезделуі анағұрлым көп мөлшерде өтуі керек, тек сонда ғана клеткада қажет белоктың иРНҚ-ның көшірмелері көп болады және осыған сәйкес көптеген негативтік шоғырларда іздеп отырған геннің 0 көшірмелері бар деп есептелінеді.

Бірқатар жағдайларда белок синтезделетін клеткаларды табу мүмкін болмайды, ал кейде қажет белоктың синтезделуі мардымсыз өтеді. Осыларға байланысты геномның қажет фрагментін (генін) синтездеу іске   аспайды, өйткені матрицалық иРНҚ-ны клеткадан бөлу өте қиынға соғады. Мұндай жағдайда ген клонын көбейтудің екінші — геномның барлық  ДНҚ-сының клонын көбейту әдісі колданылады.   Барлық   геномның   клондарын көбейту. (ДНҚ-ның жеке фрагментінің   клонын көбейтуге   қарама-қарсы) шотган-эксперимент (ағыл. shotgun — бытыра мылтық: бірнеше   бытыраның бірі нысанаға тиеді   яғни көптеген гендерден қажет біреуін сұрыптап алуға болады) деп аталады. Бұл әдістің мәні-кез келген организмнің   жоғары молекулалы ДНҚ-сын механикалық   түрде (мысалы гидродинамикалы  әдіспен немесе ультрадыбыстың әсерімен) немесе рестриктазалармен  әр түрлі фрагменттерге  ұсақтайды. Соңғы  кезде  рестриктазалар    жиі қолданылады. Мұнда кажет геннің құрылымы белгісіз болғандықтан, алдын    ала рестриктаза таңдау    мүмкін емес, сондықтан тәжірибеде бірнеше ерекше   рестриктазалар қолданылады және олардың бірі организмнің басқа гендерімен қатар қажет генді де үзе алады деп есептелінеді. Басқаша айтқанда бұл әдіс арқылы табиғи  генді бөліп алуға болады. Ары қарай бөлінген көптеген    әр түрлі ДНҚ фрагменттері векторларға жалғанады.   Міне,      осындай  организмнің барлық   геномын сипаттайтын.рДНҚ-лар жинақтамасы генотека немесе гендер жинағы деп аталады. Гендерді генотекада плазмидалық рДНҚ-түрінде (этил спиртінің тұнбасында), әсіресе рекомбинантты лямбда фаг суспензиясы түрінде (температурасы 0°С тең антисептиктер бар ортада) сақтау өте ыңғайлы. Басқа жағдайда рекомбинантты фагтарды бактериялар клондарында да сақтауға болады. Мұндай клондарды оқтын-оқтын жаңа қоректік орталарға ауыстыру қажет. Аталған жұмыстардың көмегімен кез келген организмнің гендер жинағын алуға болады. Бұл қызықтыратын жұмыстың қиындықтары көп, олардың түрлі зерттеушілер әр қилы әдістерді қолданып жеңуде. Қазір әлемнің жүздеген зертханаларында гендер жинағы құрастырылды. Гендер жинағы ғылыми эксперименттік жұмыстарда және биотехнологиялық бағытта қолдану тапты. Олар кез келген генді немесе бірден бірнеше генді бөліп алу көзі және молекулалық генетиканың әдістемелік құралының ажырамайтын бөлігі болып саналады.

Кері транскрипцияның ашылуы құрылымды гендердің жинағын құрастыруға мүмкіндік берді. Оларды гендерге сәйкестендіріп комплементарлы ДНҚ генотекасы деп атайды, өйткені кДНҚ ешуақытта қажет генге толық сәйкес келмейді, сонымен қатар онда қосымша тізбектер де бар.

Белгілі бір организмнің толық геномы клонын көбейту үшін қажет гендер жинағының мөлшерін   геномның-молекулалық массасы-(М)  мен фрагменттің орта мөлшерін біліп және   дәлдік деңгейді (Р) таңдап,   анықтауға болады:

N =M (n x 1n) -1-P

Қоянның барлық геномын сипаттайтын гендер жинағын құрастыру үшін жоғары дәлдік деңгейде 920 мың клондар қажет. Ген инженериясының классикалық объектісі — Е. Соlі бактериясының  гендер жинағын дайындау үшін анағұрлым аз клондар саны қажет-1,4 мың. Сүтқоректілердің геномы үшін ең долбарлы есеп бойынша 800 мың—1 млн. клондар санынан құралған гендер жинағы қажет.

Эукариоттық организмдердің гендер жинағын алу үшін олардың барлық ДНҚ жиынтығын гидродинамикалық әдіс арқылы фрагменттерге бөліп, вирустарға енгізеді.

3.Қажет   генді барлық   бактериялар массасынан   алу үшін оларды қатты қоректік ортаға егеді, мұнда   бактерияның әрбір жеке   клеткасы жеке ұрпақ береді   яғни бактериялық шоғыр түзіледі.Енді гендер жинағын яғни  әр түрлі клондар арасынан бізге қажет генді табу қерек. Бұл процесс скрининг деп аталады. Гендер жинағы   аз болған сайын одан қажет генді табу оңай. Комплементарлы ДНҚ клонын көбейту әдісі гендер жинағы мөлшерін азайтуға әкеледі, дегенмен мұның өзінде де қажет генді табу үшін арнайы   әдістер қолданылады. Кең   тараған әдістің бірі шоғырларды гибридизациялау деп аталады. Ол үшін   Петри    шынысындағы  негативтік   шоғырларға (рДНҚ-сы бар   бактериялар) нитроцеллюлозалы   сүзгіні беттестіреді, бұның нәтижесінде ДНҚ молекулалары сүзгіге жабысады. Сүзгінің газонга сәйкес орны үлкен дәлдікпен мұқият белгіленуі қажет, мысалы, сүзгі мен оның астындағы газоны бар   агарды бірнеше жерден   инемен шаншиды. Бұдан кейін сүзгіні тез арада 0,5 М NаОН-пен өңдейді, онан соң бейтараптайды. Бұның нәтижесінде қос тізбекті ДНҚ молекулалары денатурацияланып жеке тізбектерге ажырап, интроцеллюлозамен байланысады. ДНҚ молекуласын нитроцеллюлозалы сүзгіде берік бекіту үшін оларды 80°С температурада қыздырады.

Ген скринингісінің келесі жауапты кезеңі сүзгіні радиоактивті зондпен өңдеу. Зонд (сүңгі) дегеніміз іздеп жатқан ген бөлігінің азоттық негіздеріне комплементарлы кішігірім ДНҚ немесе РНҚ тізбегі. Сүзгі әр уақытта ра-диоактивті изотоппен белгіленеді. Сүзгіні синтездеу үшін геннің немесе белоктың ең болмағанда кішігірім бөлігінің нуклеотидтер тізбегі белгілі болуы керек. Олардың амии қышқылдар тізбегі бойынша және генетикалық кодтың көмегімен геннің  бөлігін коделейтін нуклеотидтор тізбегін оңай алуға болады. Алайда, кодтың туылмалы (синонимділігін) екендігін ескеру қажет, сондықтан белоктың белгілі тізбегінен метионин және триптофан амин қышқылдары (олардың бірден ғана кодондары бар) болатын бөліктерінен синтетикалық олигонуклеотид — синтезделеді. Генетикалық кодтың туылмалығына байланысты ерекше жалғыз сүңгі синтездеу мүмкін болмаса (мысалы, гендегі сер-сер-про-ала амии қышқылдар қатары әр түрлі оқылуы мүмкін — АГЦАГАГГАЦГА немесе АГТТЦГГ ГГЦГЦ) синтетикалық сүңгілер сериясын немесе табиғи синтездеу қажет. Табиғи сүңгі ретінде қажет геннің функциясы жоғары өтетіні белгілі клеткадан әр түрлі жолдар арқылы алынған РНҚ-ны пайдалануға болады. Көпшілік жағдайда осындай РНҚ-дан кері транскрипция процесі арқылы алынған олигонуклеотидтік кДНҚ сүңгі ретінде жиі қолдану алды.

Сүңгі алынғаннан кейін рекомбинантты векторды талдауға кіріседі. Гендер жинағын бүкіл геномдық немесе комалементарлық ДНҚ-ның) ДНҚ (РНҚ) — сүңгімен тексереді.Сүңгі тек өзіне комплементарлы генмен ғана гибридизацияланады (байланысады). Бұның негізінде ДНҚ-РНҚ-сүңгі гибридтерінің құрылуы жатады. Сондықтан сүңгі бір тізбекті болуы және гибридизация қолайлы жағдайда өтуі қажет: жоғары температура (бірақ тым көтеріңкі емес, өйткені түзілген гибридтер қайтадан ыдырап кетеді), ұзақ уақыт (сүңгі өзінің ДНҚ-сын тауып үлгіруі үшін). Гибридизация процедурасы аяқталғаннан  кейін сүзгіні жуып артық сүңгілерден  тазалайды, өйткені сүзгіге жабысқан артық сүңгілер күшті радиоактивтік орта түзеп, гибридизация нәтижесін  бұзады.Енді қажет ген бар ДНҚ тізбегі сүңгімен байланысып, радиоактивті изотоп (фосфор немесе иод) түрінде таңбаланады. Оның орнын табу салыстырмалы қарапайым: сүзгіні кәдімгі рентген фотопленкасының үстіне басады, қажет экспозициядан соң (оның  уақыты радиактивтіліктің күшімен анықталады) фотопленканы шығарады. Сүзгідегі радиоактивті ДНҚ бар орын фотопленкада кішігірім қара дақ түрінде көрінеді. Осындай фотопленкада радиоактивті изотоппен таңбаланған генді жарықта түсірілген ізі арқылы табу әдісі радио-аутография деп аталады. Сүзгідегі дақтың орнына қарай отырып, газоннан қажет рДНҚ енген негативтік шоғырды табуға болады.

Сонымен біз қажет гені бар ДНҚ фрагментін бөліп алдық, алайда, ол әлі де болса геннің өзінен ұзындығы бойынша бірнеше нсе үлкен. Фагтық вектордың ішіне орта есеппен  15—20 мың н.ж. сиятындай етіп құрастырылатыны естеріңізде болар, ал геннің орташа ұзындығы — 1-2 мың н. ж. Міне сондықтан да жеке генді бөлу жұмысы осымен аяқталмайды. Гендер жинағынан бөлінген   ДНҚ сегментін қайтадан әр түрлі рестриктазалармен үзеді, осының нәтижесінде ұзындығы бойынша әр түрлі рестриктер немесе ДНҚ үзінділері алынады. Алынған үзінділерді электрофорезден өткізеді, мұның нәтижесінде олар агарозалық гельде ұзындығына сәйкес таралады: үзінді қысқа болған сайын, ол электр өрісінің әсерінен агарозалық гельде жылдам қозғалады. Осындай гельді бром этидиімен бояп, оның суреті бойынша рестрикттердің ұзындығын анықтайды. Бұдан кейін жауапты кезең — ДНҚ-ны денатурациялау арқылы жалғыз тізбекті үзінділер алып, оларды нитроцеллюлозалы сузгіге ауыстыру басталады. Ол үшін электрофорез аяқтала салысымен агарозалық гельді тұздың қанықтырылған ерітіндісіне батырып, сүзгі қағаздың үстіне орналастырады. Гельді нитроцеллюлозамен жабады, ал олардың үстіне бірнешн құрғақ сүзгі қағаздарын салып престейді. Тұз ерітіндісі құрғақ сүзгі қағазына сіңеді, ол үшін ерітінді гельден, онан соң нитроцеллюлозалы сүзгіден өтуі керек. Гельдегі ДНҚ үзінділері ерітіндімен бірге тасымалданады, бірақ нитроцеллюлозалы сүзгіде тұтылып бекінеді. ДНҚ үзінділерінің нитроцеллюлозалы сүзгідегі орындары электрофорез пластинкасындағы орналасу тәртібіне дәлме-дәл келеді. Сонымен электрофорездегі рестриктер таңбасы нитроцеллюлозалы сүзгіде алынды. Бұл әдісті Саузерн Э. ұсынды, сондықтан ол Саузерн блотинг (ағыл. to blot— қағазға сорылу) деп аталады. Саузерн бойынша блотинг әдісінің маңызы жалпы геномнан жеке гендерді бөлуде арта түседі. Бұл молекулалық деңгейдегі күрделі жұмыс үлкен мұқияттылықты керек етеді. Мысалы, сүтқоректілер клеткасының геномы 109 н.ж. құралған болса, онда ұзындығы тіпті 5000 н. ж. тең жалғыз ген геномның бар болғаны ядролық ДНҚ-ының 0,00005 %-ін ғана құрайды.

Әдісті РНҚ үшін де қолдануға болады. Мұнда гибридизация өткізу үшін бірқатар өзгерістер енеді. Бұл әдіс Нозерн блотинг деп аталады (Саузерн — оңтүстік деген мағынаны білдірсе, керісінше Нозерн-солтүстік әдісі де-ген атау пайда болды). Қалған операциялар генотеканың скринингісіндей өтеді: нитроцеллюлозалы сүзгіде ДНҚ денатурацияланып, радиоактивті сүңгімен гибридизацияланады және қажет ген орналасқан ДНҚ үзінділері радиоаутографияның көмегімен табылады.

Рекомбинантты ДНҚ технологиясында шоғырларды гибридизациялау әдісінен басқа қажет генді тауып анықтаудың тағы фенотиптік және иммунологиялық екі әдісі белгілі.

Фенотиптік әдісі ізделіп отырған геннің клетканың фенотипін шұғыл өзгертетініне негізделген. Мұндай клетка ізделіп отырған ген енбеген клеткалардан қоректік ортада өсу қабілеттілігі бойынша көзге түреді. Рекомбинантты ДНҚ-ны фенотиптік сұрыптау әдісінің бір мысалын жоғарыда рВR322 плазмидасын вектор ретінде таңбалауынан байқауға болады: қажет гені бар рДНҚ тек ампицилинді ортада ғана өсе алады, ал векторға енбеген ДНҚ-ның  басқа  үзінділер мұндай  ортада жойылып  кетеді.

Плазмидалық векторды β — галактозидаза ферментінің гені арқылы таңбалап, қажет бактериялық клонды фенотипі бойынша іріктеуге болады. Бұл ферменттің дисахарид лактозаны және оның аналогтарын ажырататынын білеміз. Аналог ретінде 5-бром —4-хлор —3-индолил — р — галактозид қосылысын алуға болады, оны генетиктер Х-гал деп атайды. β— галактозидаза одан ашық көгілдір түсті бояу — бромхлориндолды ажыратады. Плазмидаға β — галактозидазаның генін енгізіп, рДНҚ құрастыруға болады. Осы ферменттің гені жоқ Е. Соlі немесе басқа бактерияларға аталған ген бар векторды енгізіп, олар өсіп жатқан ортаға Х-гал қосса, онда ген бойынша рекомбинантты клеткалар көгілдір түсті, ал бастапқы клеткалар түссіз шоғырлар түзейді. Енді, тәжірибеде β— галактозидаза генінің арасын арнайы рестриктазаның көмегімен үзіп, орнына қажет ДНҚ үзіндісін жалғайды, мұның нәтижесінде β — галактозидаза гені активтілігін жоғалтады. Осындай рекомбинантты ДНҚ-мен трансформацияланған клеткалар қатты ортада түссіз шоғырлар түзейді, оларды бастапқы   векторы бар   клеткалардан (көгілдір) оңай ажыратуға болады.

Иммунологиялық әдіс геннің өнімі – белок құрамымәлім болса қолданылады. Бұл әдіс белокқа антизаттар синтездей алу мүмкіндігіне сүйенеді. Алдымен рекомбинантты молекулалар бар клетка шоғырын агардың үстінде лизиске ұшырайды. Онан соң поливинил пластинкасына антизаттарды бекітіп, антиген (геннің өнімі)— антизат байланысу реакциясын жүргізеді. Антизаттар тек өзіне сәйкес белоктармен ғана байланысады. Петри шынысындағы белоктың яғни қажет геннің орнын радиоактивті элементпен (J125 т. б.) белгіленген антизаттар арқылы табады. Полимерлі пластинкада радиоактивті бөліктердің орналасу тәртібі бойынша активті гендері бар бактериялардың шоғырын табуға болады.

ОСТАВЬТЕ ОТВЕТ