Скрининг. Ген скринингі туралы түсінік

0

Жоспары:

1.Ген скринингі туралы түсінік

2.Ген скринингінің кезеңдері

Лекция мәтіні :

1.Қажет   генді барлық   бактериялар массасынан   алу үшін оларды қатты қоректік ортаға егеді, мұнда   бактерияның әрбір жеке   клеткасы жеке ұрпақ береді   яғни бактериялық шоғыр түзіледі.Енді гендер жинағын яғни  әр түрлі клондар арасынан бізге қажет генді табу қерек. Бұл процесс скрининг деп аталады. Гендер жинағы   аз болған сайын одан қажет генді табу оңай. Комплементарлы ДНҚ клонын көбейту әдісі гендер жинағы мөлшерін азайтуға әкеледі, дегенмен мұның өзінде де қажет генді табу үшін арнайы   әдістер қолданылады. Кең   тараған әдістің бірі шоғырларды гибридизациялау деп аталады. Ол үшін   Петри    шынысындағы  негативтік   шоғырларға (рДНҚ-сы бар   бактериялар) нитроцеллюлозалы   сүзгіні беттестіреді, бұның нәтижесінде ДНҚ молекулалары сүзгіге жабысады. Сүзгінің газонга сәйкес орны үлкен дәлдікпен мұқият белгіленуі қажет, мысалы, сүзгі мен оның астындағы газоны бар   агарды бірнеше жерден   инемен шаншиды. Бұдан кейін сүзгіні тез арада 0,5 М NаОН-пен өңдейді, онан соң бейтараптайды. Бұның нәтижесінде қос тізбекті ДНҚ молекулалары денатурацияланып жеке тізбектерге ажырап, интроцеллюлозамен байланысады. ДНҚ молекуласын нитроцеллюлозалы сүзгіде берік бекіту үшін оларды 80°С температурада қыздырады.

2.Ген скринингісінің келесі жауапты кезеңі сүзгіні радиоактивті зондпен өңдеу. Зонд (сүңгі) дегеніміз іздеп жатқан ген бөлігінің азоттық негіздеріне комплементарлы кішігірім ДНҚ немесе РНҚ тізбегі. Сүзгі әр уақытта ра-диоактивті изотоппен белгіленеді. Сүзгіні синтездеу үшін геннің немесе белоктың ең болмағанда кішігірім бөлігінің нуклеотидтер тізбегі белгілі болуы керек. Олардың амии қышқылдар тізбегі бойынша және генетикалық кодтың көмегімен геннің  бөлігін коделейтін нуклеотидтор тізбегін оңай алуға болады. Алайда, кодтың туылмалы (синонимділігін) екендігін ескеру қажет, сондықтан белоктың белгілі тізбегінен метионин және триптофан амин қышқылдары (олардың бірден ғана кодондары бар) болатын бөліктерінен синтетикалық олигонуклеотид — синтезделеді. Генетикалық кодтың туылмалығына байланысты ерекше жалғыз сүңгі синтездеу мүмкін болмаса (мысалы, гендегі сер-сер-про-ала амии қышқылдар қатары әр түрлі оқылуы мүмкін — АГЦАГАГГАЦГА немесе АГТТЦГГ ГГЦГЦ) синтетикалық сүңгілер сериясын немесе табиғи синтездеу қажет. Табиғи сүңгі ретінде қажет геннің функциясы жоғары өтетіні белгілі клеткадан әр түрлі жолдар арқылы алынған РНҚ-ны пайдалануға болады. Көпшілік жағдайда осындай РНҚ-дан кері транскрипция процесі арқылы алынған олигонуклеотидтік кДНҚ сүңгі ретінде жиі қолдану алды.

Сүңгі алынғаннан кейін рекомбинантты векторды талдауға кіріседі. Гендер жинағын бүкіл геномдық немесе комалементарлық ДНҚ-ның) ДНҚ (РНҚ) — сүңгімен тексереді.Сүңгі тек өзіне комплементарлы генмен ғана гибридизацияланады (байланысады). Бұның негізінде ДНҚ-РНҚ-сүңгі гибридтерінің құрылуы жатады. Сондықтан сүңгі бір тізбекті болуы және гибридизация қолайлы жағдайда өтуі қажет: жоғары температура (бірақ тым көтеріңкі емес, өйткені түзілген гибридтер қайтадан ыдырап кетеді), ұзақ уақыт (сүңгі өзінің ДНҚ-сын тауып үлгіруі үшін). Гибридизация процедурасы аяқталғаннан  кейін сүзгіні жуып артық сүңгілерден  тазалайды, өйткені сүзгіге жабысқан артық сүңгілер күшті радиоактивтік орта түзеп, гибридизация нәтижесін  бұзады.Енді қажет ген бар ДНҚ тізбегі сүңгімен байланысып, радиоактивті изотоп (фосфор немесе иод) түрінде таңбаланады. Оның орнын табу салыстырмалы қарапайым: сүзгіні кәдімгі рентген фотопленкасының үстіне басады, қажет экспозициядан соң (оның  уақыты радиактивтіліктің күшімен анықталады) фотопленканы шығарады. Сүзгідегі радиоактивті ДНҚ бар орын фотопленкада кішігірім қара дақ түрінде көрінеді. Осындай фотопленкада радиоактивті изотоппен таңбаланған генді жарықта түсірілген ізі арқылы табу әдісі радио-аутография деп аталады. Сүзгідегі дақтың орнына қарай отырып, газоннан қажет рДНҚ енген негативтік шоғырды табуға болады.

ОСТАВЬТЕ ОТВЕТ