Фагтық векторлар

0

Жоспары:

  1. Фагтық векторлар туралы түсінік

2.Космидтер және фазмидтер

Лекция мәтіні :

1.Фагтық векторлар.   Вектор ретінде   бактериялармен қатар вирустар да қолданылады. Олардан вектор алу әдістемесі лямбда (λ) фагында жете зерттелген. Лямбда фагтың ДНҚ-сы қос тізбекті және формасы түзу, оның геномы 48,5 мың н. ж. тұрады. Фаг ДНҚ-сының 12 н.ж. құралған комплементарлы жабысқақ ұштары бар. Олар, фаг клеткаға енгеннен кейін бір-бірімен бірігіп, ДНҚ сақиналы формаға   ауысады. Сақиналы ДНҚ   репликациялық форма болып саналады. Лямбда фагтың ДНҚ

молекуласында 60-тай ген бар. Фагтың геномында лизистік даму мен ұрпағын көбейту үшін қажет гендері (маңызды) жоқ екі учаскесі бар. Бірінші учаске фаг геномының орталық бөлігінде    (маңызды   емес   гендер) орналасқан,   оның      ұзындығы 22,0 мың н.ж. тең, екінші учаске P мен Q                                                                                                                                                                                                 гендері арасында орналасқан, ұзындығы 3,0 мың н. ж. тең.Міне, осы бөліктерді бөтен ДНҚ молекуласымен ауыстыруға болады. Лямбда фагтың вектор ретінде кең таралуы осы қасиеті мен ерекшелігіне байланысты, бұдан басқа оның орташа фаг екендігі бұрыннан белгілі.

Сонымен фагтың басына 25.0 мың н. ж. құралған бөтен ДНҚ-ны енгізуге болады. Фагтың қалыпты геномы 48,5 мың н.ж. құралғанымен, оның басына 38,0 мын, н.ж. кем емес және 53,0 мың н. ж. артық емес ДНҚ жинала алады, фагтың белокты капсиды ДНҚ-ның осындай мөлшерлерін қоршай алады. Лизистік дамуға қажет ген 29,0 мың н.ж. тең болғанымен, вектордың қалыпты тіршілік етуіне қажет фаг геномының мөлшері 38,0 мың н.ж. кем болмауы керек. Ғалымдар қазіргі кезде лямбда фагтың негізінде аталған шектеулер мен фаг қасиеттерін ескеріп, түрлі рестриктазалардың көмегі бірқатар векторлық молекулалар құрастырды: харон — λфаг, λgt — фаг, ЕМВ1З, λFIХ, λZАР және т. б.

Кейінгі уақытта жалғыз тізбекті ДНҚ -сы бар фаг — М1З негізінде де жақсы векторлар алынды. Жетілген М1З фагының жалғыз ДНҚ молекуласының ұзындығы 6,5 мың н.ж. тең. Клеткаға енгеннен кейін қос тізбекті репликациялық формаға айналып, өзінің 100—200 көшірмесін синтездейді. Ары қарай асимметриялы синтез жүреді: жетілген фагтың құрамына кіретін жалғыз тізбекті ДНҚ ғана синтезделеді. М1З фагы клетканы лизиске душар еткізбейді, бірақ оның бөлінуін бәсеңдетеді. Осының нәтижесінде жетілген фагтар клеткадан ортаға үздіксіз бөлініп тұрады. М1З фагының вектор ретінде негізгі артықшылығы жалғыз тізбекті векторлық ДНҚ-ны ыңғайлы жеке күйде тасымалдай алу қабілетіне байланысты. Мұндай ДНҚ-ның нуклеотидтер қатарының Сэнгер әдісімен

тез анықталуы генетикалық эксперименттерді жеңілдетеді. Тағы да, қазір пайдаланылатын барлық векторларға қарағанда, оларды бөлу және көшірмелерін алу оңайға соғады.

Жоғарыда баяндалғандардан фаг негізінде алынған векторлардың бірнеше артықшылықтарын байқауға болады. Бірақ, олардың сыйымдылығы шектелген, сондықтан рекомбинантты ДНҚ-ны молекулалық массасы бойынша іріктеу керек. Мұндай кемшілік космид деп аталатын векторлық молекулаларда кездеспейді.

2.Космидтер. Космид — лямбда фагтың соs — учаскесі (жабысқақ ұштар) бар плазмида яғни тіршілігі екі жақты ДНҚ-ның гибридтік молекуласы. Оларды алғаш   рет 1978 ж.. Дж. Коллинз бен Б. Хон ашты. Космидтік плазмидалық бөлігі оның бактерияларда репликациялануына мүмкіндік береді, ал лямбда фагтың геномына   жататын бөлігі -— соs тізбек — космидтің фаг капсидінің ішіне  in vitro жағдайында оралуына және реципиенттік клеткаға трансдукциялануына мүмкіндік береді. Сонымен, космидтер клеткаға трансформация жолымен емес, кәдімгі   инфекция арқылы   ене алады. Мұның өзі   трансформация процесінің тиімділігін ең аз дегенде 100 есе арттырады.

Космидтік векторларда мөлшері 33—49 мың н.ж. бөтен ДНҚ фрагменттерін көбейтуге болады. Космидтер сыйымдылығы ең үлкен векторлар, сондықтан эукариоттық ДНҚ-ның үлкен фрагменттерінің көшірмелерін және геномның гендер банкісін (жинағыш) клондардың ба-рынша аз санымен алу үшін арнайы құрастырылған.

Фазмида. Фаг  ретінде де, плазмида ретінде де дамуға қабілетті фаг пен плазмиданың арасындағы гибридтер фазмида деп аталады. Мұндай векторда СоlЕ1 мен λ фагтың инициация нүктесі бар және олар бактериофаг сияқты лизистік, плазмидалар сияқты лизистік емес   дамуғақабілетті.

Фазмидалық векторлардың сыйымдылығын лямбда фаг негізіндегі векторлармен салыстыруға болады, ол космидтерден анағұрлым аз.

Сонымен жоғарыда баяндалған мәліметтерден ген инженериясының векторлар системасы   микроорганизмдердің және олардың генетикалық элементтерінің қасиеттеріне негізделгенін байқауға болады. Векторлық   молекулаларға қойылатын негізгі талаптардың бірі, оларда рестрикциялық нүктелер болуы керек екендігін де атап өттік. Кейбір векторларда рестрикциялық бөліктер артық   болуы мүмкін. Мұндай жағдайда, ондай бөліктерді векторлардан делеция (бір немесе бірнеше нуклеотидтерді ДНҚ-дан иондық сәулелер және т. б. әсерімен үзілуі)   көмегімен «алып» тастайды.

Керісінше, вектордың керекті бөлігіңде   эксперимент үшін аса қажет және рестриктаза үзе алатын   тізбектер жоқ болуы да мүмкін. Бұл үшін химиялық синтездеу арқылы рестриктаза тани алатын нуклеотидтер тізбегі бар қысқа синтетикалық олигонуклеотид алынады. Лигазаның көмегімен қысқа синтетикалық олигонуклеотид вектордың керекті бөлігіне жалғанады. Оларды   линкер — жалғаулық (ағыл. біріктіру сөзінен) деп атайды. Линкерде әр түрлі бірнеше рестриктазалар үшін тізбектер бар болса, оларды полилинкер деп атайды.

ОСТАВЬТЕ ОТВЕТ